- 选题背景和意义：
嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)免疫疗法是近年来发展最为迅速的肿瘤免疫细胞疗法。 CAR-T细胞具有对肿瘤细胞的杀伤不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)限制等优势, 在难治复发的B细胞白血病和淋巴瘤患者中取得了令人振奋的效果, 尤其是靶向CD19的CAR-T细胞。近几年，CAR-T疗法在脑胶质瘤、前列腺癌、肺癌等实体瘤方面的研究也取得了巨大的进展，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一
根据编码CAR融合蛋白的编码基因是否整合至T细胞的基因组中，目前CAR-T细胞分为组成型CAR-T和mRNA CAR-T。所谓组成型CAR-T，即通过慢病毒或专座酶等方式将编码CAR的融合基因稳定的整合至T细胞基因组中，实现CAR基因持续稳定的在T细胞中表达，而mRNA CAR-T则通过电穿孔或者转染试剂将能够表达CAR基因的质粒导入至T细胞，实现CAR基因在T细胞中一过性表达。这两种形式的CAR-T各有优势，同时也各有缺点。对组成型的CAR-T来讲，主要缺点是存在“on-target off tumor toxicity”的风险，所谓“on-target off tumor toxicity”，即CAR-T进入体内后，只要有表达靶向抗原的细胞存在，CAR-T就会接受靶细胞刺激，一直处于激活状态，并发挥杀伤作用。以靶向CD19的CAR-T疗法治疗B细胞淋巴瘤为例，CAR-T在完全清除体内恶性B细胞后，仍然对体内新产生的CD19阳性的正常B细胞进行杀伤，导致患者在接受anti-CD19 CAR-T治疗后发生持续性B细胞发育不全症（persistent B-cell aplasia）。实际上这一点在实体瘤的治疗中更为突出，因为目前CAR-T细胞治疗实体肿瘤的研究中选择的大多是肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA），这些抗原往往在某些正常组织中会有低量的表达，例如HER2、EGFR等，因此CAR-T治疗实体瘤时，更容易发生“on-target off tumor”毒性，并且随着体内大部分肿瘤细胞被CAR-T清除，这种“on-target off tumor”毒性会愈发明显。如果脱靶组织为肺、心脏、肝脏、脑部等重要器官时，治疗过程中可能出现严重临床副反应，甚至导致患者死亡。而mRNA CAR-T虽然可以避免上述组成型CAR-T的缺点，但是由于mRNA在T细胞中只是一过性表达，使得mRNA CAR-T在体内抗肿瘤作用的持久性不足。本课题设计的基于复制子RNA的mRNA CAR-T，一方面避免了组成型CAR-T存在的“on-target off tumor toxicity”的风险，而相较于传统的mRNA CAR-T，提高了CAR基因在T细胞中的表达持续时间，有利于进入体内的持续抗肿瘤作用。
- 课题关键问题及难点：
- 复制子RNA的非结构基因序列达到11kb以上，构建编码CAR的复制子RNA质粒总长将达到15kb左右，而构建方法为PCR线性化质粒各片段，之后通过同源重组形成环形质粒，由于片段较长，PCR过程可能存在突变位点。
- 相较于其他细胞，对T细胞转染效率极低，此外构建的质粒较大，不利于转染。因此在本课题中，将会就如何提高对T细胞的转染效率进行研究。
- 质粒载体以及RNA复制子的高水平复制及表达蛋白也对T细胞有一定毒性，如何协调毒性和T细胞的杀伤能力。
- 文献综述（或调研报告）：
1989年，Xiong用氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）替换了感染性SIN的结构蛋白基因，同时采用辅助的SIN，以提供包装所需的结构蛋白，这种SIN复制子RNA可在宿主细胞内稳定存在至少7个病毒感染周期。而在转染细胞16~20h后，每个细胞内的CAT多肽可达108个拷贝。Liljestrom构建了将结构基因和非结构基因分开的SFV表达载体系统。在这一系统中，非结构蛋白上游为噬菌体SP6或T7聚合酶启动子，病毒的结构基因编码区被删除，但仍含有包装信号（VPs）以及亚基因组启动子。插入的外源基因位于甲病毒的26S亚基因组启动子和3rsquo;非翻译区及转录终止信号序列A69之间。病毒辅助质粒载体含有完整的结构蛋白基因和主要的顺式调控作用元件。辅助质粒缺乏包装信号。这种结构必须通过SP6或T7RNA聚合酶启动子在体外对“全基因组”进行转录和加帽，获得5rsquo;端含有帽子结构的重组RNA，用于体外表达或免疫动物。由于这种系统以原核启动子（SP6）启动，表达效率不高，同时因RNA的转录和加帽，增加了试验操作的不便。
Diciommo等人将RNA复制子系统改建成了以DNA为基础的甲病毒载体，又称DNA－RNA系统。这种载体为携带了病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA，它缺失了病毒结构蛋白基因。DNA－RNA载体通过RNA聚合酶Ⅱ依赖性的表达序列，如人巨细胞病毒（CMV）早期启动子/增强子，启动自我复制的甲病毒载体的转录。同时，它在甲病毒本身的终止信号（A69）后插入强转录终止信号SV40poly（A），正常终止转录，并在RNA的3rsquo;末端加上polyA(A)尾，进一步增强了自身稳定性。该质粒DNA转染宿主细胞后，可利用宿主RNA聚合酶Ⅱ在细胞核内转录，合成甲病毒复制酶，再合成亚基因组RNA及大量外源蛋白。DNA质粒载体克服了甲病毒RNA复制子疫苗必须进行体外转录和加帽以及操作、保存和运输均不便的缺点。HerweiJer等人把辛德毕斯病毒的cDNA置于劳氏肉瘤病毒长末端重复序列启动子的下游，组装入pBS质粒，转染3T3、HepＧ2和293等哺乳动物细胞，均有绿色荧光蛋白报告基因的表达。将质粒转染大鼠肌肉也可获得高效表达。在分化的肌细胞中，表达水平比传统的RSV表达载体高出200倍。质粒性辛德毕斯病毒载体体内表达也是瞬时型，转染5天后表达量开始下降，最长持续到16天左右。
Karl Ljungberg,Alan C. Whitmore等人的研究描述了一种新型基因疫苗，该疫苗基于从质粒DNA转录的委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）复制子。该质粒在巨细胞病毒立即早期启动子（VEE DNA）的转录控制下编码VEE复制子。 VEE DNA在体外始终表达比常规DNA疫苗多3至15倍的绿色荧光蛋白。此外，用DNA转录的VEE复制子转染诱导凋亡和I型干扰素产生。与等剂量的常规DNA疫苗相比，用编码I型人类免疫缺陷病毒gpe160的VEE DNA接种小鼠可显着提高体液反应多个数量级。在VEE DNA剂量降低10倍和100倍时也观察到了这些增加。通过gamma;干扰素和白介素2酶联免疫斑点法测定的细胞免疫应答在以较低剂量用VEE DNA免疫的小鼠中明显更高。但是，由VEE DNA编码的抗原诱导的免疫应答独立于完整的I型干扰素信号传导途径。此外，与仅VEE DNA相比，DNA发射的VEE复制子诱导了VEE复制子颗粒（VRP）增强的有效启动，使体液和细胞免疫提高了至少1个数量级。重要的是，与VRP相比，用VEE DNA免疫不会诱导任何抗VRP中和抗体。 DNA疫苗效力的提高和载体免疫力的降低可能最终对人类疫苗接种策略的设计产生影响。
Naohisa Yoshioka等人的研究中指出人诱导多能干细胞(iPSCs)的产生为再生医学治疗多种人类疾病的发展带来了巨大的希望。然而，在缺乏整合DNA载体的情况下，诱导多能干细胞的产生仍然是个问题。在此，其描述了一种简单的、可高度复制的基于RNA的iPSC生成方法，该方法利用一个单一的、合成的自复制的VEE-RF RNA复制子，该复制子表达四个重编程因子(OCT4、KLF4和SOX2，使用c-MYC或GLIS1)，在调控RNA降解之前处于一致的高水平。
- 方案（设计方案、或研究方案、研制方案）论证：
本选题方案的实验步骤主要为将甲病毒非结构蛋白编码基因、复制酶进行复制所需的序列元件以及CAR融合蛋白编码基因插入到质粒DNA中，由细胞RNA聚合酶II体内转录成复制子RNA（基于DNA）。质粒DNA直接转染细胞，在CMV启动子控制下由细胞RNA聚合酶Ⅱ胞内转录成复制子RNA，再在复制酶控制下复制RNA。外源基因及CAR融合蛋白编码基因由亚基因组mRNA启动子（26S subgenomic mRNA promoter）控制转录成mRNA，并高水平表达。通过细胞实验和动物实验观察CAR基因的表达水平以及CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
实验室具备本选题实验方案所需要的载体质粒以及成熟的质粒基因编辑技术，具备CAR-T细胞技术所需的一切设备、材料。具备完善的细胞实验和动物实验条件，可以定量地观察和比较传统技术与本选题方案的质粒所转染的T细胞的CAR融合蛋白表达水平以及对于肿瘤细胞的杀伤能力。
Karl Ljungberg,Alan C. Whitmore等人的研究描述了一种新型基因疫苗，该疫苗基于从质粒DNA转录的委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）复制子。该质粒在巨细胞病毒立即早期启动子（VEE DNA）的转录控制下编码VEE复制子。 VEE DNA在体外始终表达比常规DNA疫苗多3至15倍的绿色荧光蛋白。此外，用DNA转录的VEE复制子转染诱导凋亡和I型干扰素产生。与等剂量的常规DNA疫苗相比，用编码I型人类免疫缺陷病毒gpe160的VEE DNA接种小鼠可显着提高体液反应多个数量级。在VEE DNA剂量降低10倍和100倍时也观察到了这些增加。也论证了本选题的载体转染T细胞后，CAR基因的表达水平可以更高。
- 进度安排：
2019.11 进入实验室，学习分子生物学以及CAR-T相关知识及技术
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
